لوله های نمونه گیری

لوله های نمونه گیری دارای یک درب، دیواره، سورفاکتانت، ضد انعقاد، ژل جدا کننده، ژل فعال کننده لخته هستند. هر کدام از اجزای نامبرده ممکن است با تست های مربوطه تداخل کنند.

دیواره لوله

لوله های خلا در کل استوانه ای بوده و دارای طولی معادل 50 تا 150 میلی متر و قطری معادل 10 تا 20 میلی متر هستند. اکثر آنها دارای طول 75 تا 100 میلی متر و قطری حدود 13 میلی متر هستند که حجم 2 تا 10 میلی لیتر خون را در خود جای می دهند- لوله های میکرو برای جمع آوری خون نوزادان بطور معمول طولی معادل 40 تا 50 و قطری بالغ بر 5 تا 10 میلی متر دارند- در گذشته این لوله ها از موادی مانند سودالیم (sodalime) یا بوروسیلیکات ساخته می شدند- پس از مدتی مشخص شد که سودالیم از خود عناصری مانند کلسیم و منزیم را آزاد می کند. این لوله ها خلا  خود را تا 200 روز حفظ می کنند .

امروزه لوله های پلاستیکی جای لوله های شیشه ای را گرفته اند. مواد سازنده این لوله ها شامل پلی اتیلن ترفتالت (polyethylen terephthalate (PET))، پلی افلین (polyethylen and poltpropylene (PP))، پلی استر، پلی اکریلیک، پلی تترا فلئورواتیلن، پلی سیلوکسان (polysiloxane)، پلی وینیل کلرید، پلی اکریلونیتریل و پلی استیرن می باشد. مزایای پلاستیک در مقایسه با شیشه شامل کاهش خطر شکستگی، افزایش مقاومت در برابر شوک های دمایی، افزایش تحمل فشار سانتریفیوژ، کاهش بار سانتریفوژ، تسهیل دفع توسط سوزاندن، و کاهش هزینه های مصرفی می باشد. معایب لوله های پلاستیکی شامل نفوذ پذیری بالاتر در برابر گازها می باشد. PP و PET شایعترین مواد سازنده لوله های پلاستیکی می باشند. لوله های ساخته شده از PET نشکن بوده و خلا خود را تا مدت بسیار زیادی حفظ می کنند. لوله های PP نفوذپذیری کمتری به آب در مقایسه با PET دارند، این ویژگی باعث حفظ حجم مواد ضدانعقادی مایع در نمونه خون می شود. به دلیل کاهش حجم مواد ضدانعقاد مایع در لوله های PET (به دلیل افزایش تبخیر)، سازندگان این لوله ها تصمیم به ساخت لوله های با دو دیواره به خصوص برای تست های انعقادی گرفتند. این لوله ها دارای دیواره ای از PP می  باشند که مانع از تبخیر ضدانعقاد سیترات می شوند، دیواره خارجی از PET ساخته شد که باعث شفافیت لوله و مشاهده میزان نمونه می شود. علاوه بر این، به دلیل هیدروفوب بودن سطح داخلی لوله های پلاستیکی و چسبیدن رشته های فیبرین، پلاکت ها و نتیجتاً لخته مانع جداسازی آسان و کامل لخته توسط سانتریفیوژ معمول می شود. یک راهکار برای مرتفع کردن این مشکل ساخت لایه درونی شبه شیشه و هیدروفیل می باشد. روش دیگر شامل پوشاندن لایه داخلی با مواد سورفاکتانت، پلیمرهای محلول در آب یا پلیمرهای نامحلول حاوی پلیمرهای هیدروفوبیک می باشد. البته سورفاکتانت ممکن است توسط تماس خون با دیواره لوله جدا شود و با تست های انجام شده تداخل نماید. برای رفع این مشکل سازندگان این لوله ها سورفاکتانت را مستقیماً با پلاستیک ادغام می کنند.

چندین مطالعه لوله های پلاستیکی و شیشه ای را با توجه به تست های بیوشیمی بالینی، اندوکرینولوژی، مولکولی، سرولوژی و انعقادی مورد مقایسه قرار دادند. به استثنای تفاوت معنی دار در برخی آنالیت ها، هیچ گونه اختلاف مهم بالینی مشاهده نشد.

سورفاکتانت

سورفاکتانت ها بطور معمول برای کاهش جذب غیراختصاصی در تست های سنجش بر پایه ایمنی استفاده می شوند. برای کسب نتیجه دلخواه از سورفاکتانت، نوع و میزان آن باید به دقت انتخاب شود. در صورت زیاد بودن ممکن است باعث کنده شدن آنتی بادیهایی شود که بطور غیرفعال به سطح جامد متصل شده اند. لوله های تجاری در دسترس ممکن است حاوی سورفاکتانت های مختلفی باشند که به منظور بهبود جریان خون به داخل لوله، توزیع بهتر فعال کننده لخته دیواره و کاهش تمایل اتصالی پروتئین ها، اریتروسیت ها و پلاکت ها و دیواره استفاده می شوند. در غیر اینصورت با چسبیدن سرم یا پلاسما ممکن است نتایج را تحت تأثیر قرار دهد. اکثر محققین از سیلیکون برای کاهش جذب خون به دیواره استفاده می کنند که ممکن ایت با تعداد زیادی از تست ها تداخل داشته باشد. مطالعات نشان می دهند که سیلیکون می تواند با تداخل با غشاء الکترود های اختصاصی یون، باعث افزایش ولتاژ و درنهایت افزایش کاذب منیزیم و لیتیوم شود. سیلیکون همچنین با اتصالات آویدین- بیوتین که در تست های ایمونواسی استفاده می شود با پوشاندن فیزیکی آنتی بادی ها با تست هایی مانند اریتروپوئیتین، پرولاکتین، و hCG تداخل نماید. برخی سیلیکون ها توانایی فعال کردن پلاکت ها را دارند. همچنین مواد سورفاکتانت ممکن است باعث افزایش کاذب تری یدوتیرونین، سنجش های ایمنی رقابتی و غیر رقابتی مانند ویتامین B₁₂ و مارکرهای سرطان، و تشکیل کمپلکس با پروتئین واکنش دهنده C (CRP) و افزایش کاذب آن و افزایش میزان مثبت های کاذب در تشخیص آنتی ژن های سطحی هپاتیت B شود.

درب لوله

درب لوله ها دارای سایزی متناسب با قطر داخلی لوله می باشد و بر اساس نوع لوله دارای رنگ های مختلفی است. درب لوله باید قابلیت ورود آسان سوزن داشته باشد و خود به خود باعث بسته شدن روزنه ایجاد شده شود (self-sealing). مواد مناسب تشکیل دهنده درب لوله ها شامل سیلیکون، ایزوبوتیلن- ایزوپروپن، استرین بوتادین butadiene) (styrene، پلیمر مشترک اتیلن- پروپیلن، پلی کلروپرن، لاستیک بوتیل و لاستیک بوتیل هالوژنه می باشد. به دلیل تماس نمونه با درب لوله ممکن است باعث تداخل در برخی تست ها شود. مطالعات مختلف نشان دهنده اختلاف در زیست پذیری (bioavailability) و تعادل زیستی (bioequivalence) داروها در صورت استفاده از پلاستی سایزر (plasticizer) تریس فسفات (TBEP) می باشند. TBEP به منظور افزایش انعطاف و نرمی درب استفاده می شود اما با جدا کردن داروها از پروتئین های اتصالی خود در پلاسما، باعث افزایش جذب داروها توسط اریتروسیت ها و کاهش کاذب سطح پلاسمایی آنها شود. داروهایی که تحت تأثیر TBEP قرار می گیرند شامل کوئینیدین، پروپانولول، یدوکائین، داروهای ضد افسردگی سه حلقه ای و داروهای فنوتیازینی (کلروپرومازین و فلوفنازین) می باشند.

روان کننده درب

سیلیکون یا گلیسرول برای روان سازی و تسهیل ورود درب به لوله و بازکردن درب لوله بکار می روند. این روان کننده ها همچنین باعث کاهش چسبنده گی اریتروسیت ها و لخته به درب لوله می شوند. برای اندازه گیری تری گلیسرید و گلیسرول نباید از گلیسرول استفاده شود زیرا گلیسرول از اجزای هر دو سنجش می باشد. روان کننده های سیلیکونی ارجح هستند زیرا کمترین تداخل را با اندازه گیری آنالیت ها دارد. اما سیلیکون پوشاننده لاستیک درب ممکن است بطور کاذب باعث افزایش منیزیم یونیزه و تری یدوتیرونین توتال شود. همچنین سیلیکون ممکن است از لاستیک جدا شود و تست های اسپکتروسکوپی جرمی را تحت تأثیر قرار دهد. بنابراین روان کننده را باید یکی از منابع ایجاد خطا در تست های بیوشیمی بالینی مد نظر داشت.

ژل جداکننده

لوله های استفاده شده برای جداسازی سرم معمولا دارای یک ژل جداکننده هستند که بین سلولها و سرم در طول سانتریفیوژ استفاده می شوند. ژل های جدا کننده باعث بهبود قابل توجه پایداری سرم و پلاسما، افزایش بازده سرم و تسهیل ذخیره و انتقال نمونه می شود. مزایای ژل جداکننده شامل 1- استفاده آسان، 2- کاهش زمان مورد نیاز برای جداسازی سرم به دلیل فعالسازی لخته، 3- افزایش بازده سرم یا پلاسما، 4- کاهش آیروسل ها و خطرات ناشی از آنها، 5- کاهش نیاز به سانتریفیوژ دوباره، 6- رفع نیاز استفاده از لوله دیگر برای ذخیره نمونه و 7- رفع نیاز به استفاده از دو برچسب برای لوله ذخیره می باشد. به این دلیل که وزن مخصوص پلاسما و سرم بین 1.026 g/cm³ تا 1.031 g/cm³ ، و وزن مخصوص لخته بین 1.092 تا 1.095 g/cm³ می باشد، ژل جدا کننده باید وزن مخصوصی بین 1.03 g/cm³ تا 1.09 g/cm³ (ترجیحاً 1.04 ) داشته باشد. به ندرت در صورت غلظت بالای پروتئین نمونه یا وجود مواد حاجب رادیوگرافی و نتیجتاً افزایش وزن مخصوص پلاسما یا سرم، ممکن است ژل بین بخش سلولی و مایع نمونه قرار نگیرد. برخی داروها مانند فنی توئین، فنوباربیتال، کاربامازپین، کوئینیدین و لیدوکائین ممکن است جذب ژل شوند. پس از 24 ساعت در 4 درجه میزان این داروها ممکن است 20 تا 50 درصد کاهش یابد. پروژسترون پس از 6 روز ذخیره در لوله حاوی ژل تا 50 درصد کاهش نشان می دهد. تکه های آزاد شده از ژل و گلبول های چربی در نمونه های حاوی ژل، ممکن است با پوشانیدن و عایق کردن الکترود ها، تداخل با اتصال آنتی بادی به فاز جامد، و پوشاندن کووت، باعث خطا در این سنجش ها شود.

technician placing blood tubes in the laboratory centrifuge

مواد فعال کننده لخته

برای جداسازی سرم خون باید کاملا لخته شود. در لوله های شیشه ای بار منفی شیشه با فعال کردن انعقاد از مسیر داخلی این مهم را در طول 30 دقیقه انجام می دهد، اما در لوله های پلاستیکی برای کاهش زمان لخته شدن نیاز به موادی برای فعال کردن انعقاد می باشد. این مواد شامل شیشه، سیلیکا، کائولین یا خاک حاوی سیلیس می باشد. این مواد سریعا باعث ایجاد لخته می شوند درحالیکه فعال کننده های خاصی مانند سیلیکات های غیر ارگانیک نیازمند زمانی بین 30 تا 60 دقیقه هستند. میزان استفاده از این مواد بین 0.1 درصد تا 1 درصد وزن سیلیکا متفاوت می باشد و سطحی معادل 40 تا 80 درصد دیواره را توسط سیلیکا می پوشاند.

ضد انعقادها

انواع مختلفی از لوله های نمونه گیری برای آزمایشات مختلف طراحی شده است (2). برخی دارای ضد انعقاد و برخی بدون ضد انعقاد می باشند. برای جلوگیری از نمونه گیری در لوله های اشتباه درب هر نوع لوله توسط رنگ خاصی مشخص می شود. برای مثال رنگ بنفش برای لوله محتوی EDTA، سبز برای هپارین، آبی برای سیترات و خاکستری برای فلورید سدیم اختصاص داده شده است. نوع و نسبت ضد انعقاد باید مناسب آزمایش مربوطه باشد. برای آزمایشات روتین هماتولوژی از EDTA ، برای آزمایشهای انعقادی و سرعت رسوب اریتروسیت ها (ESR) از سیترات و برای برخی دیگر از هپارین استفاده می شود. لوله های حاوی ضد انعقاد دارای نشانه ای روی خود هستند که میزان خون مورد نیاز برای تأمین نسبت خون و ضد انعقاد را مشخص می نماید. مقدار کمتر یا بیشتر خون می تواند باعث خطا در آزمایشات مختلف شود. این مهم در لوله های خلأ با میزان خلأ ایجاد شده که باعث نسبت مناسبی از خون و ضد انعقاد می شود، بدست می آید.

ضد انعقاد پیشنهاد شده برای شمارش و مورفولوژی سلولی EDTA می باشد. دو شکل این ضد انعقاد شامل K₃EDTA و K₂EDTA مورد استفاده می باشد. در لوله های آماده برای CBC به دلیل مایع بودن و قابلیت حل شدن بالای آن، از ضد انعقاد K₃EDTA استفاده می شود. K₃EDTA باعث رقیق شدن حدود 1 تا 2 درصدی نمونه می شود در صورتی که K₂EDTA به صورت پودر خشک شده روی دیواره لوله درآمده و باعث رقیق شدن نمی شود. EDTA به میزان تقریباً 5/1 میلی گرم پودر برای جلوگیری از انعقاد یک میلی لیتر خون کافی است (مهبد). EDTA می تواند به برخی فلزات مانند یوروپیوم که در برخی از معرف ها در سنجش های ایمنی وجود دارد، یا روی و منیزیم که کوفاکتور بسیاری از آنزیم های (آلکالن فسفاتاز) مورد استفاده در سنجش ایمنی می باشد، متصل می شود. آنزیم آلکالن فسفاتاز در اندازه گیری برخی هورمون ها مانند پاراتیروئید و ACTH با روش کمی لومینسانس استفاده می شود. در این سنجش ها افزایش EDTA می تواند باعث کاهش کاذب این هورمون ها شود. علاوه بر این پروتئین هایی که دارای محلی برای اتصال یون های دو ظرفیتی مانند کلسیم و منیزیم هستند، ممکن است دچار تغییر ساختمانی، و تداخل در واکنش آنتی ژن آنتی بادی شود. EDTA همچنین باعث خروج آب از سلولها و رقیق شدن 3 تا 5 درصدی پلاسما، و در نتیجه تغییر در اندکس های خونی و هماتوکریت می شود. بنابراین لوله محتوی EDTA باید به دقت تا نشانه موجود روی لوله پر شود تا نسبت مناسب بین خون و EDTA باعث به وجود آمدن خطاهای ذکر شده نگردد.

برای آزمایش های انعقادی و سرعت رسوب اریتروسیت ها از سیترات سدیم استفاده می شود. سیترات سدیم شامل محلول 105/0 مولار یا 129/0 مولار (2/3 درصد برای نمک 2 آبه و 8/3 درصد برای نمک 11 آبه) به نسبت یک به چهار برای آزمایش ESR و نسبت یک به نه برای آزمایش های انعقادی مانند PT و PTT استفاده می شود.

هپارین به صورت کنژوگه با لیتیوم، سدیم و آمونیوم بعنوتن ضد انعقاد استفاده می شود. هپارین بعنوان کوفاکتوری برای آنتی ترومبین III با مهار ترومبین از فعال شدن ترومبین، فاکتور X_a و نتیجتاً تولید فیبرین جلوگیری می نماید. هپارین به مقدار 3/14 واحد در میلی لیتر از خون استفاده می شود. اگر چه دامنه بین 10 تا 30 واحد نیز قابل قبول می باشد.  هپارین یک ضد انعقاد موثر در مقدار اندک می باشد که تآثیر کمی نیز روی متغییرها دارد. هپارین به صورت هپارین لیتیوم، هپارین آمونیوم و هپارین سدیم در لوله های درب سبز وجود دارد. هپارین بر خلاف EDTA باعث تغییر یون هایی مانند کلسیم نمی شود. هپارین نباید برای آزمایش های انعقادی و هماتولوژی استفاده شود. پلاسمای هپارینه ضد انعقاد ترجیحی برای اندازه گیری پتاسیم می باشد و از آزاد شدن پتاسیم از پلاکت ها در هنگام تشکیل لخته جلوگیری می نماید. هپارین لیتیوم می تواند برای تست های بیوشیمی به استثناء اندازه گیری لیتیوم و فولات استفاده شود. برای لیتیوم می توان از سرم استفاده کرد. همین طور هپارین سدیم نیز نمی تواند برای اندازه گیری سدیم استفاده شود، درحالیکه ضد انعقاد ترجیحی برای اندازه گیری عناصر کمیاب، سرب و تست های سم شناسی می باشد. هپارین آمونیوم ممکن است نیتروژن اوره خون را در صورت اندازه گیری از طریق آمونیوم محدود سازد.

هپارین باعث رقیق شدن نمونه می شود بنابراین نمک هپارین بصورت متداولی در لوله های نمونه گیری استفاده می شود. هپارین به الکترولیت ها متصل و باعث تغییر غلظت یون های آزاد و متصل می شود. برای به حداقل رساندن اتصال کلسیم در سرنگ های هپارینه، ترکیب هپارین با الکترولیت متوازن توسعه یافت. هپارین به دلیل اینکه الکترود های یون کلرید برای یون های شبه هپارین که دارای انرژی هیدراسیون بالاتری هستند، انتخابی عمل می کنند، باعث تداخل در اندازه گیری کلرید می شود. علاوه بر این هپارین ممکن است با واکنش های آنتی ژن آنتی بادی نیز مداخله نماید. اگر چه هپارین باعث کاهش واکنش برخی آنتی بادیها خصوصاً در مرحله پرسیپیتاسیون در سیستم آنتی بادی ثانویه می شود، با استفاده از سیستم با فاز جامد این مداخله به حداقل رسیده است. هپارین نباید برای آزمایش های پرسیپیتاسیون کرایوگلوبولین ها استفاده شود، زیرا رسوب ممکن است با تشکیل کمپلکس بین هپارین و فیبرونکتین و کمپلکس های رسوب دهنده در سرما مانند کمپلکس با فیبرین و فیبرینوژن شود. هپارین با تداخل در اتصال بروموکرزول سبز با آلبومین (اما نه با بروموکرزول بنفش) باعث کاهش کاذب آن می شود. هپارین به صورت غیر اختصاصی به پروتئین ها متصل شده و باعث تداخل با سنجش اسپکترومتریک جرمی پپتیدها می شود.

تقریباً 3 ساعت پس از نمونه گیری حدود 9 میلی گرم درصد از غلظت اولیه گلوکز کاهش می یابد. ضد انعقاد فلورید سدیم به دلیل مهار آنزیم انولاز و نتیجتاً گلیکولیز تا 3 روز گلوکوز را حفظ کرده و  برای اندازه گیری گلوکوز مناسب می باشد. فلورید سدیم به میزان 5/2 میلی گرم برای مهار گلیکولیز در یک میلی لیتر خون کافی است. لیتیوم یدواستات نیز با مهار آنزیم گلیسر آلدهید-3-فسفات دهیدروژناز و مهار گلیکولیز می تواند برای حفظ گلوکوز نمونه تا 3 روز استفاده شود. البته در صورت آلودگی باکتریایی نمونه، فلورید نمی تواند به مقدار کافی گلیکولیز را در باکتری مهار نماید و تأثیر کمی روی حفظ گلوکوز دارد. باید توجه داشت که در نمونه های با لکوسیت، اریتروسیت و پلاکت بالا قبل از اینکه مهار کننده هایی مانند فلورید و یدواستات مأثر واقع شود، کاهش سریع و قابل توجهی از گلوکوز اتفاق می افتد. در نوزادان درصورت استفاده نکردن از مهار کننده به دلیل هماتوکریت بالا پس از 5 ساعت از نمونه گیری 68 درصد از گلوکوز در دمای آزمایشگاه مصرف می شود. برای حل این مشکل استفاده از مهار کننده اولین آنزیم در چرخه گلیکولیز، یعنی هگزوکیناز پیشنهاد شده است. برای مثال مانوز (mannose) در ترکیب با فلورید برای حفظ بهتر گلوکوز استفاده می شود. مانوز یک مهار کننده رقابتی بوده و تنها برای 4 ساعت مأثر است، پس از سه ساعت تأثیر فلورید آغاز می شود. به این ترتیب از ابتدای نمونه گیری از مصرف گلوکوز جلوگیری می شود. ترکیب فلورید و مانوز هر کدام به میزان 2 میلی گرم برای مهار گلیکولیز یک میلی لیتر خون مأثر می باشد.

برخی لوله ها نیز فاقد ضد انعقاد بوده و برای تهیه سرم بکار می روند. سرم برای اکثر آزمایش های بیوشیمی، بانک خون و ایمونواسی استفاده می شود. برخی از این لوله ها در انتها دارای ژل فعال کننده لخته می باشند. در هنگام سانتریفوژ یا باقیماندن طولانی نمونه سلولها به زیر ژل نفوذ کرده و سرم روی آن قرار می گیرد. برای ذخیره سرم در این لوله ها لازم به لوله دیگری نبوده و بطور مستقیم و بدون جداکردن سلولها می تواند ذخیره گردد.

برای آزمایشاتی که نیازمند حفظ سلولها می باشد، برای مثال کشت سلولی، ضد انعقاد مصرفی باید قابلیت زنده نگه داشتن سلولها را داشته باشد. اسید سیترات دکستروز (ACD) برای حفظ گلبول های قرمز نمونه استفاده می شود. ACD در صورت نگهداری نمونه در 1 تا 6 درجه تا 21 روز برای حفظ گلبول های قرمز مأثر می باشد.